Este protocolo da una muy buena calidad en la tinción por hematoxilina de núcleos y estructuras citoplasmáticas. Aunque se puede combinar con otros colorantes complementarios, es buena por sí sola. Se emplea para estudiar estructuras celulares por lo que fijación debe ser muy buena y el grosor de los cortes no mayor de 5 µm. Es una tinción en dos pasos. En el primero se añade una solución férrica que se une a los grupos carboxilo de las proteínas y un segundo paso con hematoxilina que se une a este hierro. La solución de diferenciación eliminará hematoxilina del tejido hasta que la tinción se considere idónea. Algunos orgánulos celulares se describieron con esta tinción antes de la aparición del microscopio electrónico.
Procedimiento
Partimos de muestras que han sido fijadas e incluidas en parafina. Estas muestras se han cortado en secciones de unas 5 µm de grosor y adheridas a portaobjetos recubiertos con gelatina-alumbre.
1.- 2x10 min en xileno para desparafinar
2.- 2x10 min en etanol 100º
3.- 10 min en etanol 96º
4.- 10 min en etanol 80º
5.- 10 min en etanol 50º
6.- 5 min en H2O destilada
7.- Toda la noche. Solución férrica.
Sulfato amónico de hierro NH4Fe(SO4)2·12H2O) 5 g
H2O destilada 100ml
8.- 3x1 min en H2O destilada
9.- Toda la noche. Hematoxilina alcohólica.
Hematoxilina 0.5 g
Etanol 96º 100 ml
Iodato sódico (o potásico) 25 mg
10.- 3x5 min. H2O corriente
11.- Solución férrica al 1%
El tiempo de diferenciación varía según el tejido y lo que queramos observar. Con esta concentración, el tiempo puede variar entre 1 y varios minutos. Podemos incrementar la concentración o disminuirla para controlar mejor los tiempos. Se puede controlar el progreso de la diferenciación en el microscopio añadiendo unas gotas de solución férrica sobre el tejido.
La diferenciación se produce porque el hierro disuelto compite con el previamente unido al tejido por la hematoxilina.
12.- 3x10 min. H2O corriente
13.- 5 min en etanol 80º
14.- 5 min en etanol 96º
15.- 2x10 min en etanol 100º
16.- 2x10 min en xileno
17.- Montado con medio de montaje
Resultados
Tiñe de azul oscuro numerosas estructuras y tipos celulares. Destaca una buena tinción nuclear y estructuras citoplasmáticas como mitocondrias, citoesqueleto (células musculares) y otros orgánulos. También la mielina de los nervios.
Consejos
Las estructuras que se tiñen con este protocolo pueden variar dependiendo de la diferenciación. Por ejemplo, si usamos una solución de diferenciación ligeramente ácida deja como últimas estructuras teñidas a los núcleos. Pero si usamos una solución algo básica o con hierro III (como la ferrocianuro potásico) el citoplasma y los orgánulos serán los últimos en desteñirse. La solución de sulfato amónico de hierro está entre estos dos extremos.
Productos
Xileno
Etanol de 50º, 70º, 80º, 96º y 100º
Hematoxilina
Sulfato amónico de hierro.12 H2O
H2O destilada
H2O corriente
Medio de montaje
Material
Cubetas de tinción
Cesta para portas
Cubreobjetos
