Cuando hay minerales en los tejidos, como por ejemplo en el hueso, en la dentina, o se producen en procesos patológicos calcificantes en tejidos blandos, es muy difícil obtener buenas secciones finas, bien sea de material incluido en parafina o de material en congelación. En estos casos el proceso histológico debe incluir un paso en el que se eliminan tales minerales denominado generalmente como descalcificación, puesto que en la mayoría de los casos se eliminan minerales de calcio. Hay, sin embargo, ocasiones en que esto no es posible o deseable, y a veces se requiere estudiar el tejido óseo en su estado original, por lo que es necesario obtener secciones de tejido mineralizado sin descalcificar (ver más abajo).
El principal mineral duro de los tejidos animales es la hidroxiapatita, mineral de fosfato cálcico, [Ca10(PO4)6(OH)2], que se encuentra en los huesos distribuido entre las fibras de colágeno. Estos minerales se encuentran en equilibrio con su solución saturada según las siguiente reacción:
Ca10(PO4)6(OH)2 = 10Ca2+ + 6PO43- + 2OH-
Si eliminamos alguno de los componentes a la derecha de la reacción, el mineral (a la izquierda) se disolverá para equilibrar de nuevo la solución. Este es el principio de los descalcificantes. A la hora de elegir los tiempos y sustancias descalcificantes hay que tener en cuenta si estamos interesados en el hueso compacto o en el esponjoso. Por ejemplo, las sales minerales tardan más en disolverse en el hueso compacto.
La descalcificación se realiza normalmente después de la fijación, aunque a veces se hace tras la inclusión en parafina eliminando la sales de calcio sólo de las micras más superficiales del plano de corte de la muestra. Es importante realizar una buena fijación del tejido puesto que será incubado en soluciones ácidas relativamente agresivas. Además, es bueno eliminar bien los restos de fijador con lavados abundantes para evitar reacciones química con los agentes descalcificadores. Los tiempos de fijación del hueso que se va a descalcificar suelen ser mucho mayores que para otros tejidos. El mejor método de fijación es la perfusión, pero si no es posible es conveniente hacer piezas pequeñas con sierras de dientes muy finos y eliminar los tejidos que rodean al hueso antes de sumergirlo en fijador. Los mejores fijadores son Bouin, mezclas de formalina con zinc, o FAA (formol, acético, alcohol).
Hay dos grupos principales de agentes descalcificantes: los ácidos y los quelantes de calcio. A continuación veremos los descalficantes más comunes.
Basados en ácidos
Los ácidos aportan hidrógenos y eliminan iones hidroxilos del medio por lo que la reacción antes mencionada tiende hacia la solubilización del mineral.
H+ + 2OH- = H2O
Hay dos grupos de ácidos: los fuertes (inorgánicos) y los débiles (orgánicos). Los ácidos fuertes suelen ser rápidos pero son muy agresivos por lo que el tiempo debe ser el mínimo posible, ya que si es excesivo producen daños en los núcleos y maceran el tejido. Los ácidos débiles son más lentos pero preservan mejor al tejido. Los ácidos fuertes más usados son el ácido clorhídrico, el ácido nítrico, mientras que como débil se suele emplear el ácido fórmico. Cuanto más agresivos son los ácidos más se deterioran las enzimas y los antígenos para realizar pruebas enzimáticas o inmunocitoquímicas. Los ácidos también deterioran los ARN citosólicos por lo que las hibridaciones in situ se ven comprometidas
El ácido clorhídrico y el ácido nítrico se suelen usar al 5-10 % en agua. Descalcifican rápidamente y su acción no debería prolongarse más de 24-48 horas. No se recomiendan para inmunocitoquímica ni ensayos enzimáticos. Se emplean para muestras pequeñas y diagnósticos rápidos.
El ácido fórmico es el ácido débil más usado como descalcificante. Se puede usar en solución acuosa (5-10 %), tamponado (con ácido cítrico) o combinado con formalina. En este último caso la descalcificación va acompañada de fijación. El tiempo de tratamiento con ácidos débiles es más prolongada (1 a 10 días), dependiendo del tamaño y tipo de hueso, y de la concentración de ácido. La solución debería cambiarse cada 24 o 48 horas.
Otros ácidos débiles como en el acético o el ascórbico se usan cuando se van a realizar pruebas inmunocitoquímicas. La descalcificación se realiza en estos casos con pH por encima de 2.5.
Agentes quelantes
Los agentes quelantes son aquellas sustancias orgánicas que pueden unirse covalentemente a iones metálicos formándose un compuesto soluble llamado quelato de metal. El EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) secuestra iones de calcio, presentes en la superficie de los cristales de hidroxiapatita, por lo que progresivamente irá disminuyendo el tamaño del cristal. Se usa entre el 10 y el 14 % en soluciones acuosas o tamponadas. Es un proceso lento, la descalcificación se puede extender durante semanas, pero aporta una buena preservación de la estructura tisular. Así, cuando el tiempo no es importante es el método recomendado. La solución debería cambiarse cada 3 a 5 días. Se puede acelerar el proceso aumentando el pH de la solución (superior a 7), pero esto puede afectar a la calidad del tejido.
En cualquiera de los dos métodos, ácidos o quelantes, hay variables que pueden disminuir el tiempo de descalcificación, como son el aumento de la temperatura o una agitación suave del tejido. Hay otros más agresivos como sonicación o microondas, pero hay que controlar los daños al tejido.
Averiguar el grado de descalcificación es importante para determinar el tiempo necesario que tienen que incubarse las muestras en las soluciones descalcificadoras. Ya se comentó que incrementos de tiempo innecesarios puede repercutir en la calidad del tejido, pero si el tiempo es corto pueden quedar cristales en el tejido que dificulten el corte y procesamiento del hueso. El calcio del mineral termina en solución y si la solución descalcificante se cambia periódicamente se podrá averiguar cuándo se ha producido la descalcificación completa mediante la medición de la concentración de calcio en el medio. Cuando se emplean ácidos como descalcificantes se puede realizar una comprobación química: se añade oxalato de amonio a la solución descalcificante, que ha sido neutralizada con hidróxido amonio. Si hay calcio en la solución se forman precipitados de oxalato de calcio, lo que indica que aún quedan minerales en el hueso.
A veces, sin embargo, es necesario mantener el contenido mineral del hueso y la descalcificación no se lleva a cabo. En estos casos es posible obtener secciones mediante procedimientos no convencionales. Por ejemplo, se puede serrar el hueso en lonchas más a menos finas y luego limar las superficies hasta llegar a un grosor óptimo para su observación con el microscopio. También se puede infiltrar el hueso con resinas que al polimerizar alcanzan una dureza similar a la del hueso, y posteriormente cortar la muestra incluida con microtomos especiales como el ultramicrotomo cuando se usan cuchillas de diamante. Otra posibilidad es realizar cortes por congelación.
La detección de antígenos mediante anticuerpos, o inmunocitoquímica, se puede ver afectada por tratamientos previos como la descalcificación. En general la descalcificación parece afectar selectivamente a según qué antígenos y qué método de descalcificación se use. En cualquier caso, los ácidos fuertes deben ser evitados.
